ความหมายของคำว่า สถานที่. การโคลนนิ่งระดับโมเลกุลหรือวิธีใส่สารพันธุกรรมแปลกปลอมเข้าไปในเซลล์
สถานที่, - ยัง - กิน; - ยัง (-yon, - ena); มุ่งมั่น ดู
1. อะไร. กำหนดหาสถานที่สำหรับบางสิ่งบางอย่าง วางหนังสือบนชั้นวาง
2. ใคร (อะไร) สถานที่ (ในบางห้องที่อยู่อาศัย) วางผู้เยี่ยมชมไว้ในห้องแยกต่างหาก
3. ใคร (อะไร) ให้ที่ไหนสักแห่งเพื่อจุดประสงค์บางอย่าง วางลูกของคุณไว้ในโรงเรียนอนุบาล วางเขาไว้ในโรงพยาบาล นำเงินออมของคุณไปฝากไว้ในธนาคารออมสิน
4. อะไร. พิมพ์เผยแพร่ ส่งบทความลงนิตยสาร ลงโฆษณาในหนังสือพิมพ์.
รูปลักษณ์ที่ไม่สมบูรณ์สถานที่ - ใช่ - ใช่
คำนาม.ห้อง - ฉัน เพศ
ตัวอย่างการใช้คำว่า สถานที่ในบริบท
- - อันที่สองอยู่กับเพื่อนบ้านชั้นบน Monastyrevs มีห้องว่างตอนนี้คุณทำได้ สถานที่สักตรงนั้น
- - เอาล่ะ บอกเขาว่าฉันถูกรถม้าหรือรถตู้ชน และฉันต้องทำเช่นนั้น สถานที่ไปที่ห้องพยาบาล
- ฉันต้องการ สถานที่บางสิ่งในตู้นิรภัยของโรงแรม
- ในที่สุดพวกเขาก็ต้องทำ สถานที่ทอมไปที่โรงพยาบาลบ้า
- มันเป็นไปไม่ได้ คุณต้องเห็นด้วย สถานที่ความรักทั้งหมดของฉันที่มีต่อสุนัข
สถานที่
สถานที่
สถานที่
ฉันจะวางคุณจะวาง (คุณจะวางเรียกขาน) นกฮูก (ถึงใส่).
1. ใคร-อะไร- เพื่อให้มีสถานที่สำหรับใครบางคนเพื่อให้ใครบางคนตั้งถิ่นฐานที่ไหนสักแห่ง วางแขกไว้บนโซฟา รองรับนักท่องเที่ยวในโรงแรม.
2. ใคร-อะไร- วาง, จัดเรียง, นอนลง. ฉันวางแหล่งกำเนิดแสงไว้ด้านหลัง หนังสือทุกเล่มสามารถวางในตู้ได้ วางคณะนักร้องประสานเสียงไว้ด้านหลังเวที.
3. ใคร-อะไร- ระบุ มอบหมาย ให้ที่ไหนสักแห่ง (ล้าสมัย). “ Aratov เก่าตั้งรกรากอยู่ในเมืองหลวงโดยมีเป้าหมายที่จะส่งลูกชายของเขาไปที่มหาวิทยาลัย” ทูร์เกเนฟ . “ลุงผู้ปกครองของฉันพาเขาไปที่เซนต์ปีเตอร์สเบิร์กและให้เขาเข้ารับราชการ” ทูร์เกเนฟ .
4. อะไร- เพื่อกำจัดบางสิ่งบางอย่าง, เพื่อกำหนดสถานที่, จุดประสงค์สำหรับบางสิ่งบางอย่าง. วางที่ไหนสักแห่ง เมืองหลวง. นำเงินออมของคุณไปฝากไว้ในธนาคารออมสิน วางที่ไหนสักแห่ง คำสั่งซื้อ.
5. อะไร- เสนอเพื่อตีพิมพ์หรือพิมพ์ ส่งบทความลงนิตยสาร ลงโฆษณาในหนังสือพิมพ์.
พจนานุกรมอธิบายของ Ushakov- ดี.เอ็น. อูชาคอฟ
พ.ศ. 2478-2483
บรรจุ, บรรจุ, บีบ, นอนลง; ชำระ ติดตั้ง ติดตั้ง วาง; แนบ, เกาะ, ซุก, ม้วนขึ้น, กองขึ้น, ดันเข้าไป, ดันเข้าไป, ใส่เข้าไป, ย้าย, วางออก, ยัดเข้าไป, เคล็ด, นอนลง, โหลด, ใส่เข้าไป... พจนานุกรมคำพ้องความหมาย
สถานที่ อสังหาริมทรัพย์ ฯลฯ ดูสถานที่ พจนานุกรมอธิบายของดาห์ล วี.ไอ. ดาห์ล. พ.ศ. 2406 2409 … พจนานุกรมอธิบายของดาห์ล
สถานที่ กิน กิน; ยังคง (yon, ena); อธิปไตย 1. อะไร. กำหนดหาสถานที่สำหรับบางสิ่งบางอย่าง ป. หนังสือบนหิ้ง 2. ใคร (อะไร) การตั้งถิ่นฐาน (ในห้องไหน, ที่อยู่อาศัย) P. ผู้มาเยี่ยมห้องแยก 3. ใคร (อะไร) ให้ที่ไหน เพื่ออะไร n.... ... พจนานุกรมอธิบายของ Ozhegov
สถานที่- สถานที่ สถานที่ สถานที่ (สถานที่ไม่ถูกต้อง) ... พจนานุกรมความยากลำบากในการออกเสียงและความเครียดในภาษารัสเซียสมัยใหม่
สถานที่- อะไรล. ที่ไหนและที่ไหน 1. ที่ไหน (กำหนด, จัดที่ไหนสักแห่ง, ให้จัดเก็บ, ใช้). วางลูกของคุณไว้ในโรงเรียนอนุบาล วางเงินไว้ในธนาคารออมสิน [พ่อ] พาเขาไปเซนต์ปีเตอร์สเบิร์กทันทีที่อายุได้สิบแปดปี และ... ... พจนานุกรมควบคุม
สถานที่- PLACE / PLACE PLACE / PLACE จัดเรียง / จัดเรียง จัดเรียง / จัดเรียง คลี่คลาย นกฮูก เด็ก, ภาษาพูด, เนซอฟ และนกฮูก จะทำพูดคุย แนบ/แนบ... พจนานุกรมพจนานุกรมคำพ้องความหมายของคำพูดภาษารัสเซีย
ฉันนกฮูก ดูตำแหน่ง 1., 2., 3., 4. II นกฮูก ทรานส์ ดูพจนานุกรมอธิบายของ Efremova ที.เอฟ. เอฟเรโมวา 2000... พจนานุกรมอธิบายภาษารัสเซียสมัยใหม่โดย Efremova
สถานที่, สถานที่, สถานที่, สถานที่, สถานที่, สถานที่, สถานที่, สถานที่, วาง, วาง, วาง, วาง, สถานที่, สถานที่, วาง, วาง, วาง, วาง, วาง, วาง, วาง, วาง,... ... รูปแบบของ คำ
กริยา., ใช้. เปรียบเทียบ บ่อยครั้ง สัณฐานวิทยา: ฉันจะวาง เธอจะวางและวางไว้ เขา/เธอ/มันจะวางและที่วาง เราจะวางและวางไว้ คุณจะวางและวางไว้ พวกเขาจะวางและสถานที่ สถานที่ สถานที่ วาง วาง วาง ,… … พจนานุกรมอธิบายของ Dmitriev
หนังสือ
- การตัดเกล็ดหิมะ, Victoria Viktorovna Serova, Vladimir Yuryevich Serov เกล็ดหิมะกระดาษ... ในวัยเด็กไม่มีเวทย์มนตร์เล็กๆ น้อยๆ นี้ คุณพับสี่เหลี่ยม ตัดออก กางออก กลั้นลมหายใจ และนี่คือปาฏิหาริย์ - เกล็ดหิมะทำมือ! อัศจรรย์...
สถานที่- 1) กำหนดสถานที่สำหรับบางสิ่ง (วาง วาง แขวน จัดเตรียม) 2) ชำระ จัดเตรียมที่อยู่อาศัย 3) วางใครสักคนไว้ที่ไหนสักแห่ง (ในโรงพยาบาล ในสถานเลี้ยงเด็กกำพร้า ในโรงเรียนประจำ) 4 ) ลงทุนกองทุน ( เงิน) 5) พิมพ์เผยแพร่
ตัวอย่างการใช้งาน: วางเก้าอี้ตรงมุม วางแขกในห้องมุม ฉันถูกจัดให้อยู่ในแผนกศัลยกรรม วางเงินในธนาคารพาณิชย์ที่สนใจ ในนิตยสาร New World ฉบับล่าสุดประจำปี 2013 พวกเขาตีพิมพ์บทกวีที่คัดสรรโดย กวีชื่อดัง
โพสต์- 1) จัดเรียงตามลำดับที่แน่นอน 2) แจกจ่ายให้กับบุคคลจำนวนมาก (ผู้เข้าร่วม)
ตัวอย่างการใช้งาน: วางจานบนชั้นวาง วางผ้าลินินในตู้เสื้อผ้า สั่งซื้ออย่างมีกำไร
พอดี- ใส่สิ่งของทั้งหมดหรือในปริมาณมาก
ตัวอย่างการใช้งาน: แม่สามารถเก็บสิ่งของทั้งหมดของฉันไว้บนชั้นเดียวได้ ฉันอยากจะเก็บแอปเปิ้ลทั้งหมดไว้ในตะกร้าใบเดียว
สถานที่ - สถานที่ - พอดี (s)
พอดี- 1) พอดี, หาที่ว่างให้เพียงพอ, 2) ชำระหนี้.
ตัวอย่างการใช้งาน: ฉันไม่คิดว่าจะมีคนเข้ามาที่นี่ได้มากมายขนาดนี้ ซีเรียลไม่พอดีกับขวด เราพักอยู่ในบ้านหลังเล็กๆ ริมฝั่ง
รองรับ- หาสถานที่ให้ตัวเองปักหลักปักหลัก
ตัวอย่างการใช้งาน: พอดีในบ้าน, ในห้อง, บนเก้าอี้, บนโซฟา, นั่งสบาย ๆ.
พอดี- 1) ลงตัวพอดี 2) ปักหลัก ปักหลัก ในพื้นที่จำกัด
ตัวอย่างการใช้งาน: พี่สาวน้องสาวนั่งบนเก้าอี้ตัวเดียว ฉันไม่คิดว่าจะมีคนจำนวนมากขนาดนี้สามารถอยู่ในห้องเล็กๆ แบบนี้ได้
ท้องถิ่น-1) เกี่ยวข้องกับอสังหาริมทรัพย์ 2) การเป็นเจ้าของอสังหาริมทรัพย์
ตัวอย่างการใช้งาน: กรรมสิทธิ์ที่ดินในท้องถิ่น ขุนนางท้องถิ่น
เจ้าของที่ดิน- เป็นเจ้าของโดยเจ้าของที่ดิน
ตัวอย่างการใช้งาน: คฤหาสน์, คฤหาสน์, สวนของคฤหาสน์, คอกม้า.
เติมเงิน- เพิ่ม เพิ่ม ทำให้สมบูรณ์ยิ่งขึ้น
ตัวอย่างการใช้งาน: เติมเงินในบัญชีธนาคารของคุณ เติมเสบียงอาหาร เติมคอลเลกชันของคุณ
กรอก- 1) เอามาให้ครบถ้วน, กรอกให้ครบถ้วน, 2) กรอกข้อมูลที่จำเป็น.
ตัวอย่างการใช้งาน: น้ำกำลังสูงขึ้นจนเต็มชั้นใต้ดินของบ้านอย่างรวดเร็ว กรอกแบบสอบถาม แบบฟอร์ม แบบฟอร์มใบสมัคร
แก่ขึ้น- แก่ขึ้นหรือแก่กว่า
ตัวอย่างการใช้งาน: พ่อ ปู่ พี่ชาย แม่สื่อก็แก่ แม่ก็แก่ แมวก็แก่
ล้าสมัย- 1) แก่ลง 2) เลิกใช้ ล้าสมัย เลิกใช้
ตัวอย่างการใช้งาน: ความคิดเห็นของฉันล้าสมัย ถึงเวลาเปลี่ยนแล้ว คลาสสิกไม่สามารถล้าสมัยได้ วิธีการวิจัยล้าสมัย อุปกรณ์ล้าสมัย
โฉนด- การกระทำโดยเจตนา
ตัวอย่างการใช้งาน: การกระทำอันสูงส่ง, การกระทำที่ไม่เห็นแก่ตัว, การกระทำของลูกผู้ชาย, การกระทำที่สมควร, การกระทำ.
ความผิดทางอาญา- การกระทำที่ฝ่าฝืนหลักจรรยาบรรณ ความผิด
ตัวอย่างการใช้งาน: กระทำความผิดลหุโทษ, กระทำความผิดอันเป็นอัปมงคล, ลงโทษอย่างร้ายแรงสำหรับความผิดลหุโทษ.
ผู้มีเกียรติ- 1) ควรค่าแก่การเคารพนับถือ 2) สำคัญ (เกี่ยวกับระยะทางหรือขนาดปริมาตร)
ตัวอย่างการใช้งาน: สุภาพบุรุษผู้น่านับถือผู้เฒ่า เป้าหมาย วัตถุประสงค์ที่น่านับถือ อยู่ในระยะห่างอันน่านับถือ
ขอแสดงความนับถือ- 1) ปฏิบัติต่อบุคคลด้วยความเคารพหรือแสดงความเคารพ 2) สำคัญ (เกี่ยวกับระยะทางหรือขนาดปริมาตร)
ตัวอย่างการใช้งาน: ชายหนุ่มที่น่านับถือ ท่าทางที่น่าเคารพ กิริยาท่าทางที่น่าเคารพ การแสดงออกทางสีหน้าที่น่านับถือ ท่าทางที่น่านับถือ ในระยะอันน่านับถือ
งานรื่นเริง- 1) เกี่ยวข้องกับวันหยุด 2) สง่างามสวยงาม 3) สนุกสนานรื่นเริงมีความสุข
ตัวอย่างการใช้งาน: วันที่วันหยุด กิจกรรมวันหยุด การแสดงดอกไม้ไฟ ชุดงานรื่นเริง, ชุดสูท; ชุดงานรื่นเริง; รูปลักษณ์รื่นเริง อารมณ์รื่นเริง ความทรงจำในวันหยุด
ไม่ได้ใช้งาน- 1) ไม่ทำอะไรเลย เกียจคร้าน 2) ไม่เต็มไปด้วยการงาน การงาน 3) ว่างเปล่า เปล่าประโยชน์ ไร้จุดหมาย เกิดจากความเกียจคร้าน
ตัวอย่างการใช้งาน: เป็นคนเกียจคร้านและว่างเปล่าไม่มีใครเห็นว่าเขาเกียจคร้าน ชีวิตว่างๆ วิถีชีวิตว่างๆ บทสนทนาว่างๆ คำถามว่างๆ ความสนใจว่างๆ
ใช้ได้จริง- 1) เกี่ยวข้องกับการปฏิบัติ 2) มีส่วนร่วมในธุรกิจใด ๆ โดยตรงเป็นการส่วนตัว 3) เป็นการนำความรู้และทักษะไปใช้ในทางปฏิบัติ
ตัวอย่างการใช้งาน: กิจกรรมภาคปฏิบัติ การประยุกต์ ความสำคัญในทางปฏิบัติ คู่มือการปฏิบัติ ศูนย์ปฏิบัติ ชั้นเรียนภาคปฏิบัติ ความรู้และทักษะภาคปฏิบัติ เทคนิคภาคปฏิบัติ
ใช้ได้จริง - 1) มีความรู้ในทางปฏิบัติ, ประสบความสำเร็จในด้านการปฏิบัติของชีวิต, 2) มีกำไร, สะดวก.
ตัวอย่างการใช้งาน: ผู้ปฏิบัติจริง แม่บ้าน, ภรรยา, แม่; ขั้นตอนการปฏิบัติ สี วัสดุ ใช้งานได้จริง
จัดเตรียม - 1) ให้โอกาสในการใช้หรือเป็นเจ้าของบางสิ่งบางอย่าง 2) ให้โอกาสหรือสิทธิ์ในการทำบางสิ่งบางอย่าง
ตัวอย่างการใช้งาน: ให้โอกาส จัดเตรียมเอกสาร ให้เสรีภาพในการเลือก สิทธิ ให้ฉันตัดสินใจด้วยตัวเองว่าจะมอบการจัดการอสังหาริมทรัพย์ให้กับคนใหม่หรือไม่
แนะนำ - 1) ถวายความคุ้นเคย 2) ไฮไลท์ ส่งเป็นตัวแทน 3) สมัครรับรางวัลเลื่อนยศ ตำแหน่ง 4) แนะนำ แนะนำ 5) แสดง สาธิต 6) วาดภาพบนเวที เล่น 7) จินตนาการทางจิตใจ
ตัวอย่างการใช้งาน: นำเสนอผลการวิจัย ผู้สมัครปัจจุบันจากภูมิภาค จากโรงเรียน ส่งเพื่อรับรางวัล แนะนำเจ้าบ่าวให้พ่อแม่ของเขารู้จัก แนวโน้มปัจจุบัน ทิศทางการทำงาน นักแสดงนำเสนอความรู้สึกและสถานะของตัวละครได้สำเร็จ จินตนาการถึงบางสิ่งให้เป็นที่สนใจ
ตัวแทน- 1) ได้รับเลือก 2) สะท้อนผลประโยชน์ของผู้มีส่วนได้เสีย ทุกกลุ่ม ทุกฝ่าย 3) มีเกียรติ โดดเด่น สร้างความประทับใจ
ตัวอย่างการใช้งาน: อำนาจผู้แทน อำนาจผู้แทน การประชุมผู้แทน การประชุมผู้แทน นิทรรศการผู้แทน ผู้ชายที่เป็นตัวแทน รูปลักษณ์ที่เป็นตัวแทน
ผู้บริหาร - 1) เพื่อวัตถุประสงค์ในการนำเสนอ 2) ระดับหรูหรา
ตัวอย่างการใช้งาน: ค่าความบันเทิง วัตถุประสงค์; ผลประโยชน์ของตัวแทน รถระดับผู้บริหาร, ห้องพักระดับผู้บริหาร (โรงแรม)
ผลงาน- 1) คำนาม จากกริยาเพื่อเป็นตัวแทน 2) เอกสารอย่างเป็นทางการ คำร้องขอรับรางวัล การเลื่อนตำแหน่ง 3) การแสดง การแสดงละคร 4) ภาพลักษณ์ของวัตถุและโลกในการรับรู้ของผู้คน 5) ความเข้าใจ ความรู้
ตัวอย่างการใช้งาน: การนำเสนอหลักฐานในศาล การนำเสนอเพื่อรับรางวัล การแสดงละคร ความคิดของฉัน ความคิดของคุณ รับแนวคิดเกี่ยวกับเหตุการณ์ต่างๆ มีความเข้าใจโดยทั่วไปเกี่ยวกับกระบวนการทางประวัติศาสตร์
การให้- คำนาม จากกริยาเพื่อให้: บทบัญญัติ
ตัวอย่างการใช้งาน: การจัดหาพื้นที่อยู่อาศัย การให้บริการ การจัดหาโอกาส การจัดหางานตามสัญญา
ได้รับการยอมรับ- 1) ผู้ที่ได้รับการยอมรับ (กริยาจากคำกริยา รับรู้) 2) ชื่นชมและรู้จัก
ตัวอย่างการใช้งาน: อำนาจที่ได้รับการยอมรับ ความสามารถที่เป็นที่ยอมรับ ศิลปิน นักแสดง ผู้กำกับ บุคคลสาธารณะ นักวิทยาศาสตร์ที่ได้รับการยอมรับ
ปลื้มปีติ- ความรู้สึกหรือแสดงความขอบคุณ, ความกตัญญู
ตัวอย่างการใช้งาน: กตัญญูกตเวที คำพูดกตัญญู กตัญญูกตเวที
ดูถูก- 1) อยู่ในตำแหน่งที่น่าขายหน้า, ทำให้อับอาย, 2) ดูถูก, ดูถูกดูแคลน.
ตัวอย่างการใช้งาน: ดูแคลนในสายตาของตนเอง ลดความสำคัญลง ลดบทบาทลง
ฉีกหน้า- รุกราน, รุกราน
ตัวอย่างการใช้งาน: ทำให้อับอายต่อหน้าทุกคน ทำให้ขายหน้าด้วยท่าที คำพูด ตบ กรีดร้อง
มีปัญหา- การคาดเดา, ไม่ได้พูด, ไม่น่าจะเป็นไปได้, น่าสงสัย.
ตัวอย่างการใช้งาน: การแก้ปัญหา คำกล่าว ข้อสรุป ข้อสันนิษฐาน ข้อสรุปที่เป็นปัญหาผลลัพธ์; ความเป็นไปได้ที่เป็นปัญหา
ปัญหา- มีปัญหาหรือตั้งใจที่จะแก้ไข
ตัวอย่างการใช้งาน: สถานการณ์ปัญหา บทความเกี่ยวกับปัญหา กลุ่มปัญหา แนวทางแก้ไขปัญหา บทเรียนเกี่ยวกับปัญหา การบรรยายเกี่ยวกับปัญหา
ทางอุตสาหกรรม- เกี่ยวข้องหรือมุ่งหมายเพื่อการผลิต
ตัวอย่างการใช้งาน: กระบวนการผลิต สิ่งอำนวยความสะดวกการผลิต แผนกการผลิต อุตสาหกรรมสัมพันธ์ ข้อบกพร่องในการผลิต การประชุมการผลิต อาณาเขตการผลิต
มีประสิทธิผล- การผลิต การสร้างสรรค์ การผลิต
ตัวอย่างการใช้งาน: แรงงานที่มีประสิทธิผล กำลังการผลิต
คำทำนาย- ทำนาย, ทำนาย.
ตัวอย่างการใช้งาน: ทำนายอนาคต พยากรณ์ความโชคร้ายปัญหา; ทำนายโชคดีชัยชนะ
บอกลา- ตั้งใจทำนาย
ตัวอย่างการใช้งาน: ให้เป็นสามีภรรยา เพื่อเป็นเจ้านาย เพื่อเป็นเจ้าสาว พูดเพื่อตัวเองเพื่อน้องชายของคุณ
ชาวประมง- 1) คนตกปลา 2) ผู้รักการตกปลา
ตัวอย่างการใช้งาน: ชาวประมงนั่งและยืนริมฝั่งทะเลสาบ ชาวประมงที่หลงใหล, ชาวประมงสมัครเล่น; ชาวประมงตัวจริงผู้รอบรู้และมีประสบการณ์
ชาวประมง- 1) ผู้ตกปลา 2) ผู้ชื่นชอบการตกปลา (ภาษาพูด)
ตัวอย่างการใช้งาน: ชาวประมงทำงานเป็นทีม ทีมชาวประมง ชาวประมงแก่ๆ ที่ดีจริงๆ
ตกปลา- เกี่ยวข้องกับการประมงหรือที่มุ่งหมายเพื่อการประมง
ตัวอย่างการใช้งาน: ฤดูประมง อุปกรณ์ตกปลา เรือลากอวน กองเรือประมง
ตกปลา- มีส่วนร่วมในการประมงเป็นการค้าขาย
ตัวอย่างการใช้งาน: อาร์เทลตกปลา, เรือลากอวนประมง
คำศัพท์- เกี่ยวกับพจนานุกรมหรืองานสร้างพจนานุกรม
ตัวอย่างการใช้งาน: รายการพจนานุกรม คำศัพท์ภาษา งานพจนานุกรม
วาจา-1) คำคุณศัพท์จากคำนาม คำ 2) แสดงออกด้วยคำพูดด้วยคำพูด
ตัวอย่างการใช้งาน: สงครามวาจา, การต่อสู้; วัสดุทางวาจาการผสมผสานทางวาจา
ความต้านทาน- 1) ความต้านทาน 2) คำศัพท์: ความต้านทานของวัสดุ
ตัวอย่างการใช้งาน: ความต้านทานต่อเจ้าหน้าที่, ความต้านทานต่อความประสงค์ของผู้ปกครอง, ความต้านทานไฟฟ้า, ความต้านทานการบีบอัด, ความต้านทานต่อวัสดุ การไขลาน
ความต้านทาน- ความสามารถในการต้านทาน
ตัวอย่างการใช้งาน: ความต้านทานต่อโรค การติดเชื้อ ความเครียด ความต้านทานของร่างกาย ความต้านทานของหินต่อการผุกร่อน
เปรียบเทียบได้- กริยาของคำกริยาเปรียบเทียบ; สิ่งหนึ่งที่สามารถเปรียบเทียบกับบางสิ่งบางอย่างได้
ตัวอย่างการใช้งาน: คุณค่าที่เทียบเคียงกันอย่างหาที่เปรียบมิได้กับสิ่งใดๆ
เปรียบเทียบ- 1) ขึ้นอยู่กับการเปรียบเทียบ 2) ญาติ 3) คำศัพท์ทางภาษา: ระดับเปรียบเทียบ คำคุณศัพท์เปรียบเทียบ คำวิเศษณ์เปรียบเทียบ
ตัวอย่างการใช้งาน: วิธีการวิจัยเปรียบเทียบ ภาษาศาสตร์เปรียบเทียบ ความเงียบเมื่อเปรียบเทียบ ความเจริญรุ่งเรืองที่เปรียบเทียบ คำคุณศัพท์เชิงเปรียบเทียบ, ระดับเชิงเปรียบเทียบ.
เก่า- 1) สร้างขึ้นในสมัยโบราณ 2) โบราณเก่าแก่
ตัวอย่างการใช้งาน: พรมโบราณ เหรียญโบราณ เครื่องประดับโบราณ หนังสือโบราณ คนรู้จักเก่าเพื่อนเก่า
เก่า-1) มีชีวิตอยู่หลายปี 2) แก่ แก่ 3) ใช้งานมานาน 4) (เกี่ยวกับเวลา) ที่ผ่านมา 5) เมื่อก่อน
ตัวอย่างการใช้งาน: ปู่แก่ หญิงชรา; ความแค้นเก่า บาดแผลเก่า ความเจ็บปวดเก่า ประเพณีเก่า ชุดเก่า รองเท้าเก่า บ้านเก่า เวลาเก่า ชีวิตเก่า; ที่อยู่เก่า หมายเลขโทรศัพท์ ข้อมูลเก่า
กระจก- 1) ทำจากแก้ว 2) เช่น แก้ว 3) ไร้การเคลื่อนไหว ไร้ชีวิตชีวา
ตัวอย่างการใช้งาน: แก้วแก้วเครื่องแก้ว กระจกเงา, กระจกกริ่ง; ดูเป็นแก้ว, ตาเป็นแก้ว
กระจก- มีไว้สำหรับการผลิตแก้วหรือแก้วที่ทำงานกับแก้ว
ตัวอย่างการใช้งาน: ซื้อสีโป๊วแก้ว การประชุมเชิงปฏิบัติการแก้ว, โรงงานแก้ว, วัตถุดิบแก้ว, อุตสาหกรรมแก้ว
น่าพอใจ- 1) อิ่มอร่อย แคลอรี่สูง 2) อุดมสมบูรณ์
ตัวอย่างการใช้งาน: พายแสนอร่อยจานแสนอร่อย อาหารกลางวันแสนอร่อยอาหารแสนอร่อย ชีวิตที่น่าพอใจ ฤดูหนาวที่น่าพึงพอใจ
เลี้ยงอย่างดี- ๑) ไม่หิว ๒) กินอิ่ม อ้วน ๓) อยู่อย่างอุดมสมบูรณ์
ตัวอย่างการใช้งาน: คนที่ได้รับอาหารอย่างดี เด็กที่ได้รับอาหารอย่างดี แมวที่ได้รับอาหารอย่างดี วัวที่ได้รับอาหารอย่างดี ประเทศที่ได้รับอาหารอย่างดี ยุโรปที่ได้รับอาหารอย่างดี
โชคดี- ผู้ที่ได้รับโชคลาภ; ประสบความสำเร็จ.
ตัวอย่างการใช้งาน: ผู้ประกอบการที่ประสบความสำเร็จ นักกีฬาที่ประสบความสำเร็จ การล่าสัตว์ที่มีความสุข
ประสบความสำเร็จ- 1) จบด้วยความสำเร็จ โชคดี 2) ดี ตรงตามข้อกำหนด
ตัวอย่างการใช้งาน: ธุรกิจที่ประสบความสำเร็จ การดำเนินงานที่ประสบความสำเร็จ ภาพยนตร์ที่ประสบความสำเร็จ การแสดง บทบาทที่ประสบความสำเร็จ คำพูดที่ประสบความสำเร็จ
กล่าวถึง- คำพูดเกี่ยวกับใครบางคน พูดไม่เฉพาะเจาะจง แต่พูดอย่างไม่เป็นทางการ
ตัวอย่างการใช้งาน: การกล่าวถึงนักแสดง, การกล่าวถึงโดยวิธี, การกล่าวถึงที่เกี่ยวข้อง, การกล่าวถึงในสื่อ
คำเตือน- ถ้อยคำเพื่อเตือนใจ
ตัวอย่างการใช้งาน: เตือนความจำที่สำคัญ, เตือนข้อตกลง, เตือนข้อตกลง, เตือนตัวเอง, เตือนวันเกิด, เตือนคอมพิวเตอร์
การวิจัยทางชีววิทยาจำนวนมากเริ่มต้นด้วยการกระทำง่ายๆ เพียงอย่างเดียว - นำสารพันธุกรรมจากต่างประเทศเข้าไปในเซลล์ การดำเนินการนี้เรียกว่า การโคลนระดับโมเลกุล- ด้วยความช่วยเหลือนี้ คุณจะได้รับสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม เปิดและปิดยีนแต่ละตัว ตรวจสอบผลกระทบของโปรตีนต่อกระบวนการที่ซับซ้อนบางอย่าง และอื่นๆ เราสามารถพูดได้ว่าการโคลนนิ่งระดับโมเลกุลเป็นรากฐานที่สำคัญ รากฐาน รากฐาน หากไม่มีเทคนิคที่ยอดเยี่ยมมากมายก็คงเป็นไปไม่ได้
อย่างไรก็ตาม การวาง DNA “ที่ไม่ใช่เจ้าของภาษา” เข้าไปในเซลล์นั้นไม่ง่ายอย่างที่คิดเมื่อมองแวบแรก นี่เป็นกระบวนการที่ใช้เวลานาน ใช้แรงงานเข้มข้น และหลายขั้นตอน หนังสือทั้งเล่มอุทิศให้กับการโคลนโมเลกุลและน่าเสียดายที่ในบทความแม้จะยาวมากก็เป็นไปไม่ได้ที่จะครอบคลุมรายละเอียดปลีกย่อยและความแตกต่างทั้งหมด - มีบางอย่างจะถูกละทิ้งไปอย่างแน่นอน อย่างไรก็ตาม ฉันจะพยายามพูดคุยกันสักหน่อยว่ามันคืออะไรและสิ่งที่จำเป็นในการทำให้มันสำเร็จ
แทรก
เนื่องจากเรากำลังจะแทรกยีนบางตัวเข้าไปในเซลล์ ขั้นตอนแรกที่ชัดเจนที่สุดที่เราต้องทำคือการได้รับยีนนี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในปริมาณมาก (เนื่องจาก - อนิจจา! - วิธีการทั้งหมดไม่สมบูรณ์ และเราจำเป็นต้องเตรียมตัวสำหรับ อะไร โอสำเนาของยีนนี้ส่วนใหญ่จะหายไปอย่างไร้ร่องรอยตลอดทางและไม่มีวันบรรลุเป้าหมาย)
เรียกว่ายีนแปลกปลอมที่นำเข้าสู่เซลล์ จีโนมแทรกหรือเพียงแค่ แทรก(ดูส่วนแทรก) คุณสามารถรับได้หลายวิธี
ประการแรก เราสามารถแยกมันออกจากจีโนมที่มันอยู่ได้ สมมติว่าเพื่อความเรียบง่ายว่าการแทรกของเราคือยีนช้างบางชนิด ถ้าอย่างนั้นเราต้องการ:
- รับตัวอย่างเนื้อเยื่อช้าง
- แยก DNA จากตัวอย่างนี้ (ดูการสกัด DNA)
- แยกยีนที่เราสนใจออกจาก DNA นี้และรับมันในปริมาณมาก (ใช้ PCR สำหรับสิ่งนี้) [หมายเหตุในวงเล็บว่าการได้รับยีนโดยใช้ PCR เป็นไปได้ก็ต่อเมื่อเรารู้ลำดับนิวคลีโอไทด์ของมันหรืออย่างน้อยลำดับของจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของมัน (เพื่อให้สามารถสังเคราะห์ไพรเมอร์ได้) หากเราไม่ทราบทั้งหมดนี้ เราจะต้องวิเคราะห์จีโนมของช้างก่อน]
ประการที่สอง ค่อนข้างเป็นไปได้ที่ยีนที่เราต้องการนั้นได้ถูกแยกออกจากจีโนมของช้างแล้ว และมีอยู่ในห้องสมุดยีน จากนั้นสามารถรับส่วนแทรกของเราได้จากที่นั่น (อันที่จริงเราจะต้องแก้ไขสิ่งนี้ด้วย แต่น้อยกว่าในกรณีแรก)
และประการที่สาม ไม่จำเป็นต้องใช้ยีนที่มีอยู่เป็นส่วนแทรก หากนักวิจัยกำลังจะทำงานกับยีนบางตัวที่เป็นจินตนาการของเขาและไม่ได้เกิดขึ้นในธรรมชาติ เขาก็สามารถสังเคราะห์มันขึ้นมาได้ (ดู การสังเคราะห์ยีนเทียม)
เวกเตอร์
การปล่อยส่วนแทรก "โดดเดี่ยว" เข้าไปในเซลล์ กล่าวคือ ยีนด้วยตัวมันเองโดยไม่มีส่วนเสริมใดๆ ถือเป็นเรื่องไร้ประโยชน์โดยสิ้นเชิง มีเอ็นไซม์ย่อยดีเอ็นเอ (นิวคลีเอส) จำนวนมากลอยอยู่รอบๆ เซลล์ ซึ่งจะกระโจนใส่ส่วนที่ไม่มีการป้องกันของเราอย่างมีความสุขและตัดมันเป็นชิ้นๆ เป็นผลให้การแทรกจะหายไปอย่างน่ายกย่องโดยไม่ต้องมีเวลาทำสิ่งที่มีประโยชน์ให้สำเร็จ และการโคลนจะไม่นำไปสู่ผลลัพธ์ใด ๆ
ดังนั้น เพื่อป้องกันเม็ดมีด จึงฝังอยู่ใน "ยานพาหนะ" พิเศษที่เรียกว่าเวกเตอร์ ในกรณีเบื้องต้นที่สุด เวกเตอร์เป็นเพียงลำดับดีเอ็นเอที่ใช้เย็บส่วนแทรกของเราลงไป และช่วยให้ไม่หายไปในเซลล์และบรรลุวัตถุประสงค์ของมัน
เวกเตอร์มีหลายประเภท แต่หนึ่งในนั้นได้รับความรักที่ยิ่งใหญ่ที่สุด (และสมควรได้รับ) ในหมู่นักวิจัย นั่นคือพลาสมิด เราจะเริ่มต้นด้วยพวกเขา
พลาสมิด
พลาสมิดเป็นโมเลกุล DNA ที่ค่อนข้างสั้นและมักจะเป็นทรงกลมซึ่งลอยอยู่ในไซโตพลาสซึมของเซลล์แบคทีเรีย พลาสมิดไม่เกี่ยวข้องกับโครโมโซมของแบคทีเรีย พวกมันสามารถทำซ้ำได้โดยอิสระจากแบคทีเรีย พวกมันสามารถ "คายออก" โดยแบคทีเรียออกสู่สิ่งแวดล้อมหรือในทางกลับกัน "กลืน" จากสภาพแวดล้อมนี้ ด้วยความช่วยเหลือของพลาสมิด แบคทีเรียจะแลกเปลี่ยนข้อมูลทางพันธุกรรมระหว่างกัน เช่น ถ่ายทอดความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะบางชนิดไปยังเพื่อนบ้าน
พลาสมิดมีอยู่ตามธรรมชาติในแบคทีเรีย แต่ไม่มีใครสามารถป้องกันไม่ให้นักวิจัยสังเคราะห์พลาสมิดเทียมซึ่งจะมีคุณสมบัติตามที่เขาต้องการ โดยเย็บเม็ดมีดเข้าไปแล้วปล่อยเข้าไปในเซลล์ พลาสมิดคือความว่างเปล่า ความว่างเปล่า สามารถแทรกส่วนแทรกที่แตกต่างกันลงในพลาสมิดเดียวกันได้ ดังนั้นพวกเขาจึงพยายามสร้างพลาสมิดให้เป็นสากลที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้และเหมาะสมกับทุกโอกาส
เพื่อให้พลาสมิดกลายเป็นเวกเตอร์ที่ใช้งานได้นั้นจะต้องมีลักษณะสำคัญบางประการ
การสืบพันธุ์
ประการแรก พลาสมิดจะต้องเพิ่มจำนวนและทำซ้ำในเซลล์ เพราะไม่เช่นนั้นมันจะสลายตัวอย่างรวดเร็ว และยีนที่แทรกเข้าไปก็จะหายไปตามไปด้วย เมื่อต้องการทำเช่นนี้ จะต้องมีลำดับพิเศษที่เรียกว่าต้นกำเนิดของการจำลอง ซึ่งเป็นจุดเริ่มต้นของการเพิ่ม DNA เป็นสองเท่า ในสิ่งมีชีวิตชนิดต่างๆ จุดเหล่านี้มีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกัน ดังนั้น หากเราต้องการสร้างพลาสมิดที่จะทำซ้ำในเซลล์สองประเภทในคราวเดียว (เช่น ในยีสต์และแบคทีเรีย) เราจำเป็นต้องแทรกต้นกำเนิดของการจำลองสองจุดเข้าไป
การตัด
นอกจากนี้ พลาสมิด DNA จะต้องมีพื้นที่ที่สามารถตัดเพื่อใส่ส่วนแทรกได้ เอนไซม์พิเศษที่เรียกว่าเอนไซม์จำกัดถูกใช้เป็น "กรรไกร" เอนไซม์ที่มีข้อจำกัดนั้นยอดเยี่ยมมากเพราะมันตัด DNA ไม่ใช่แค่ที่ใดก็ได้ แต่ในสถานที่ที่กำหนดไว้อย่างเคร่งครัด ซึ่งเรียกว่าไซต์ที่มีข้อจำกัด (เอนไซม์ข้อจำกัดแต่ละตัวจะจดจำเฉพาะที่ตั้งของตัวเอง และตัดเฉพาะ DNA ในนั้น - หรือใกล้เคียงเท่านั้น) โดยปกติแล้ว ตำแหน่งข้อจำกัดต่างๆ หลายแห่งที่อยู่ในจุดต่างๆ จะถูกวางไว้ในพลาสมิด ด้วยเหตุนี้ จึงสามารถตัดในตำแหน่งที่ถูกต้องได้ด้วยเอนไซม์จำกัดที่ถูกต้อง ส่วนหนึ่งของ DNA ที่มีไซต์จำกัดหลายแห่งเรียกว่า พอลิลิงค์เกอร์(ดูไซต์การโคลนหลายรายการ)
การคัดเลือก
กระบวนการที่แบคทีเรียกินพลาสมิดเข้าไปเรียกว่าการเปลี่ยนแปลง ภายใต้สภาวะทางธรรมชาติ ไม่ใช่ว่าประชากรแบคทีเรียทั้งหมดจะสามารถเปลี่ยนแปลงได้ในช่วงเวลาใดก็ตาม แต่เป็นเพียงบางส่วนเท่านั้น เซลล์ที่มีความสามารถนี้เรียกว่า มีความสามารถ(ดูความสามารถ) มีวิธีห้องปฏิบัติการที่สามารถใช้เพื่อเพิ่มจำนวนเซลล์ที่มีความสามารถได้อย่างเทียม (บางส่วนอธิบายไว้ด้านล่างในบท "วิธีใส่เวกเตอร์เข้าไปในเซลล์") แต่ถึงกระนั้นความสามารถหนึ่งร้อยเปอร์เซ็นต์สำหรับการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียก็ยังไม่สามารถบรรลุได้ .
ดังนั้น เมื่อเติมพลาสมิดเข้าไปในแบคทีเรีย เราก็จะยอมละทิ้งความจริงที่ว่า โอเซลล์แบคทีเรียส่วนใหญ่จะยังคงปราศจากพลาสมิดและไม่มีการเปลี่ยนแปลง ดังนั้นเราจะต้องแยกข้าวสาลีออกจากแกลบซึ่งก็คือเซลล์ที่ถูกเปลี่ยนรูปออกจากเซลล์อื่นทั้งหมด เมื่อต้องการทำเช่นนี้ จะใช้เทคนิคง่ายๆ แต่แยบยล
สมมติว่าเราได้สร้างยีนต้านทานยาปฏิชีวนะบางชนิดไว้ในพลาสมิดของเรา (ยีนนี้เรียกว่า เครื่องหมายเลือกโปรดดูเครื่องหมายที่เลือกได้) ตอนนี้เซลล์ที่ "กิน" พลาสมิดจะคงกระพันต่อยาปฏิชีวนะนี้และจะสามารถอยู่อย่างสงบสุขได้เมื่อมีมันอยู่ ด้วยเหตุนี้ เพื่อที่จะเลือกแบคทีเรียทั้งหมดที่เราเติมพลาสมิดที่สามารถใช้พลาสมิดนี้ตามวัตถุประสงค์ที่ต้องการได้ เราจะต้องเพิ่มยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมในการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียเท่านั้น เซลล์เหล่านั้นที่เราต้องการจะสามารถดำรงอยู่และแบ่งตัวได้เมื่อมียาปฏิชีวนะนี้ แต่เซลล์ที่เหลือจะไม่สามารถทำเช่นนี้ได้
แต่นี่เป็นเพียงจุดเริ่มต้นของการคัดเลือกเท่านั้น ความจริงก็คือเมื่อเราใส่เม็ดมีดเข้าไปในพลาสมิด นอกเหนือจากส่วนผสมที่ต้องการ (เม็ดมีดด้านในพลาสมิด) ผลพลอยได้จำนวนมากก็เกิดขึ้น (ดูด้านล่าง) ดังนั้น หากเซลล์ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะ ไม่ได้หมายความว่าเวกเตอร์ที่เราต้องการจะ "อยู่" อยู่ในนั้น ค่อนข้างเป็นไปได้ที่พวกมันกินพลาสมิดเปล่าๆ ซึ่งจะไม่มีประโยชน์สำหรับเรา
ดังนั้นเราจึงจำเป็นต้องดำเนินการคัดเลือกอีกหนึ่งขั้นตอน และสำหรับสิ่งนี้ จะต้องมีเครื่องหมายการเลือกอื่นในพลาสมิด ตัวอย่างเช่น นี่อาจเป็นยีนที่ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะบางชนิด ความละเอียดอ่อนตรงนี้ก็คือ ไซต์จำกัดของเราจะตั้งอยู่ตรงกลางของยีนนี้ หากพลาสมิดว่างเปล่าโดยไม่มีส่วนแทรก ยีนนี้จะทำงานได้ และการดื้อต่อยาปฏิชีวนะจะยังคงอยู่ หากส่วนแทรกเข้าไปดันตัวเองเข้าไปตรงกลางของยีนนี้ ยีนก็จะเสียหาย การดื้อต่อยาปฏิชีวนะจะหยุดชะงัก และการเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่อยู่ตรงนั้นจะถูกยับยั้ง นั่นคือทั้งหมดที่เราต้องทำหลังจากขั้นตอนแรกของการคัดเลือกก็แค่ย้ายเซลล์ของเราไปยังตัวกลางที่มียาปฏิชีวนะสำหรับเครื่องหมายคัดเลือกตัวที่สอง และคราวนี้เลือกโคโลนีที่ไม่เติบโต
มีวิธีอื่นในการดำเนินการคัดเลือก ตัวอย่างเช่น เป็นไปได้ที่จะวางตำแหน่งจำกัดไม่ให้อยู่ในยีนยาปฏิชีวนะ แต่อยู่ในยีนที่ "สังเกตเห็นได้" บางตัว (เช่น ยีนหนึ่งในบริเวณที่วัฒนธรรมของแบคทีเรียเปลี่ยนสี) เป็นผลให้สามารถแยกแยะอาณานิคมที่จำเป็นจากอาณานิคมที่ไม่จำเป็นได้อย่างง่ายดายด้วยตาโดยไม่มีการยักย้ายใด ๆ ตัวอย่างเช่น ระบบการเลือกสีน้ำเงิน-ขาวที่ทันสมัยมากในขณะนี้ทำงานบนหลักการนี้ (ดูหน้าจอสีน้ำเงินขาว)
โดยหลักการแล้ว คุณสามารถทำได้โดยไม่ต้องเลือกขั้นตอนที่สอง และเพียงวิเคราะห์ (เช่น การใช้ PCR หรืออิเล็กโตรโฟเรซิส) องค์ประกอบพลาสมิดของโคลนแบคทีเรียหลายตัว และเลือกโคลนที่พลาสมิดที่มียีนแทรก "ตั้งอยู่"
หากเราจะทำงานกับแบคทีเรียเท่านั้น สสารก็จะถูกจำกัดอยู่เพียงทั้งหมดที่กล่าวมาข้างต้น อย่างไรก็ตาม หากเป้าหมายสูงสุดของเราคือการวางเวกเตอร์ในเซลล์ยูคาริโอตอื่นๆ เช่น เซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เราก็จะต้องเผชิญกับการคัดเลือกอีกขั้นหนึ่ง
ความจริงก็คือพลาสมิดในเซลล์ยูคาริโอตส่วนใหญ่มีอายุได้ไม่นานและสลายตัวอย่างรวดเร็ว ดังนั้นแม้ว่าเราจะบังคับให้เซลล์ "กิน" พลาสมิด เราก็ไม่ควรหวังว่าส่วนแทรกของเราจะยังคงอยู่ในเซลล์นี้ตลอดไป เป็นไปได้มากว่ามันจะมีเวลาแสดงตัวเองเพียงเล็กน้อยก่อนที่เวกเตอร์ที่มีอยู่จะถูกนิวคลีเอสจับและหั่นเป็นชิ้น ๆ อย่างไรก็ตาม หากเวกเตอร์สามารถรวมเข้ากับจีโนมได้โดยไม่ได้ตั้งใจ (เหตุการณ์นี้เกิดขึ้นได้ยากมาก แต่ก็ไม่น่าเหลือเชื่อ) การแทรกซึมของเราจะหยั่งรากในเซลล์นี้ - และไม่เพียงแต่ในเซลล์นี้เท่านั้น แต่ในทั้งหมด ลูกหลานของมัน และเพื่อที่จะเลือกเซลล์ที่มีเวกเตอร์อยู่ในจีโนมจากเซลล์ทั้งหมด เราจะต้องมีเครื่องหมายคัดเลือกอีกตัวหนึ่ง - ยีนสำหรับการต้านทานยาปฏิชีวนะชนิดยูคาริโอตบางชนิด (เพราะตามกฎแล้วยาปฏิชีวนะของแบคทีเรียจะไม่ทำหน้าที่กับเซลล์ยูคาริโอต) โดยการเติมยาปฏิชีวนะที่เหมาะสม (เช่น สารพันธุกรรม ดู G418) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้เพาะเลี้ยงเซลล์ หลังจากผ่านไปสักระยะหนึ่ง เราก็จะได้ประชากรเพียงเซลล์เหล่านั้นซึ่งมีจีโนมเวกเตอร์ของเรา “ตั้งอยู่” เท่านั้น
นอกจากนี้ เราสามารถแทรกยีนบางตัวที่มีความเฉพาะตัวสูงเข้าไปในพลาสมิดของเราได้ (เช่น ยีน GFP โปรตีนเรืองแสงสีเขียว) โปรตีนนี้จะเรืองแสงได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ และหากเซลล์กินพลาสมิดเข้าไป ก็จะมองเห็นได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เป็นจุดเรืองแสง และในเซลล์ที่ปราศจากพลาสมิดจะไม่มีการเรืองแสง
โปรโมเตอร์ สารเพิ่มประสิทธิภาพ สารเก็บเสียง
ก่อนที่ยีนทำงานแต่ละยีนจะมี DNA ชิ้นสั้นๆ ที่เรียกว่าโปรโมเตอร์ ที่นี่เป็นที่ตั้งของเอนไซม์ที่เรียกว่า RNA polymerase ซึ่งสังเคราะห์ RNA บนเทมเพลต DNA ซึ่งเป็นขั้นตอนแรกและจำเป็นอย่างยิ่งในการแสดงออกของยีน ถ้ายีนไม่มีโปรโมเตอร์ การแสดงออกของยีนจะไม่สามารถเริ่มได้ แต่ยีนจะยังคงเงียบอยู่ และถึงแม้จะมีอยู่ในเซลล์ แต่ก็ไม่ได้แสดงออกมาในทางใดทางหนึ่ง เราสามารถพูดได้ว่ายีนที่ไม่มีโปรโมเตอร์ก็เหมือนกับรถที่ไม่มีคันเร่ง ดังนั้นพลาสมิดของเราจะต้องมีบริเวณโปรโมเตอร์อย่างน้อยหนึ่งบริเวณ ภายใต้การควบคุมของยีนแทรกที่สามารถวางได้
แต่ผู้สนับสนุนนั้นแตกต่างกัน
ประการแรก พวกเขาต่างกันในเรื่องความแข็งแกร่ง บางชนิดทำให้เกิดการถอดรหัสยีนควบคุมอย่างรวดเร็ว ส่วนบางชนิดก็เชื่องช้าโดยสิ้นเชิง
ประการที่สอง โปรคาริโอตและยูคาริโอตมีโปรโมเตอร์ต่างกัน โปรโมเตอร์โปรคาริโอตไม่ทำงานในเซลล์ยูคาริโอตและในทางกลับกัน ดังนั้นจึงเป็นความผิดพลาดร้ายแรงที่จะใส่ยีนที่ควรแสดงออกในเซลล์แบคทีเรียภายใต้โปรโมเตอร์ยูคาริโอต - มันจะเหมือนกับการปล่อยทิ้งไว้โดยไม่มีโปรโมเตอร์เลย
ประการที่สาม ยูคาริโอตมี RNA polymerase หลายประเภท - ช่วยให้มั่นใจในการสังเคราะห์ RNA ประเภทต่างๆ และอาร์เอ็นเอโพลีเมอเรสแต่ละประเภทจะรับรู้เฉพาะโปรโมเตอร์ของตัวเองเท่านั้นและ "ไม่เห็น" ตัวอื่น ดังนั้น ขึ้นอยู่กับชนิดของ RNA ที่เราเข้ารหัส (เช่น เทมเพลตหรือในทางกลับกัน กิ๊บติดผม หรือแม้แต่ไรโบโซม) เราจำเป็นต้องเลือกประเภทของโปรโมเตอร์ที่เราจะใส่ในพลาสมิด
และสุดท้าย ประการที่สี่ โปรโมเตอร์ที่แตกต่างกันถูกเปิดใช้งานในรูปแบบที่แตกต่างกัน บางส่วนมีการใช้งานอย่างต่อเนื่อง ส่วนอื่นๆ จะทำงานภายใต้เงื่อนไขบางประการเท่านั้น เช่น เมื่ออุณหภูมิโดยรอบเพิ่มขึ้น หรือมีสารบางชนิดปรากฏในเซลล์ นอกจากนี้ ในสิ่งมีชีวิตหลายเซลล์ในแต่ละเนื้อเยื่อ โปรโมเตอร์บางตัวจะถูกเปิดใช้งาน และบางตัวจะถูกปิด ตัวอย่างเช่น เป็นไปได้ที่จะเลือกโปรโมเตอร์ที่จะทำงานในเซลล์ประสาทเท่านั้น หรือเฉพาะในเซลล์ประสาทของสมอง หรือเฉพาะในเซลล์ประสาทสมองที่เป็นของนิวเคลียส subcortical อันใดอันหนึ่ง หรือเฉพาะในเซลล์ประสาทสมองกลุ่มย่อยเล็กๆ ที่เป็นของนิวเคลียสใต้คอร์ติคอลอันใดอันหนึ่ง และวงกลมนี้สามารถแคบลงได้เกือบไม่มีกำหนด
นอกจากโปรโมเตอร์แล้ว ยูคาริโอตยังมีบริเวณ DNA อื่นๆ ที่ควบคุมการแสดงออกของยีน - สารเพิ่มประสิทธิภาพ (ซึ่งช่วยเพิ่มการถอดรหัส) และตัวเก็บเสียง (ซึ่งทำให้ยีนอ่อนแอลง) พวกมันต่างจากโปรโมเตอร์ตรงที่อาจไม่ได้ตั้งอยู่ใกล้กับยีนที่ถูกควบคุม แต่อยู่ห่างจากยีนนั้นมาก
การรู้ทั้งหมดนี้ทำให้ผู้วิจัยมีอิสระอย่างน่าทึ่ง เมื่อเลือกโปรโมเตอร์ที่เหมาะสมสำหรับพลาสมิดแล้ว (และหากจำเป็น สารเสริมบางชนิด) เขาจะสามารถทำทุกอย่างที่ต้องการด้วยการแสดงออกของยีนแทรก สมมติว่าตรวจสอบให้แน่ใจว่ามันแสดงออกอย่างแรงเฉพาะในเซลล์กล้ามเนื้อและเฉพาะในการตอบสนองต่ออุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นเท่านั้น
การแปลโปรตีน
เมื่อวางเวกเตอร์ลงในเซลล์ นักวิทยาศาสตร์อาจต้องการสองสิ่งที่แตกต่างกัน:
- ดังนั้นการถอดความของยีนแทรกเท่านั้นจึงเกิดขึ้น (นั่นคือ การสังเคราะห์ RNA บนเทมเพลต DNA - ตัวอย่างเช่น นี่เพียงพอแล้วหากมีการนำ RNA ที่ไม่ได้เข้ารหัสบางตัวเข้าไปในเซลล์)
- เพื่อให้ทั้งการถอดรหัสและการแปลยีนของการแทรกเกิดขึ้น (นั่นคือ การแสดงออกของโปรตีนที่ถูกเข้ารหัสโดยการแทรก)
ในกรณีแรก เรียกว่าเวกเตอร์ การถอดเสียงในครั้งที่สอง - แสดงออก- เวกเตอร์นิพจน์มักจะซับซ้อนกว่าเวกเตอร์การถอดเสียงเล็กน้อยเนื่องจากมี:
- ลำดับฉันทามติของ Kozak ชื่อยาวนี้ตั้งให้กับชิ้นส่วนสั้นๆ (ประมาณ 10 นิวคลีโอไทด์) ที่จุดเริ่มต้นของโมเลกุล Messenger RNA ซึ่งผ่านโปรตีนตัวกลาง ทำให้แน่ใจได้ว่า mRNA นี้จับกับไรโบโซม (โดยที่คุณคาดเดาไม่ได้ ก็คือการสังเคราะห์โปรตีน) เป็นไปไม่ได้) ลำดับ Kozak เป็นลักษณะเฉพาะของยูคาริโอตเท่านั้น และจะแตกต่างกันเล็กน้อยระหว่างตัวแทนของสายพันธุ์ต่างๆ ดังนั้นเมื่อสร้างเวกเตอร์นิพจน์จำเป็นต้องแทรกลำดับที่เป็นลักษณะของสิ่งมีชีวิตเข้าไปในเซลล์ที่เรากำลังจะแทรกเวกเตอร์ นอกจากนี้ลำดับ Kozak อาจรุนแรงและอ่อนแอได้นั่นคือนำไปสู่การสังเคราะห์โปรตีนจำนวนมากหรือน้อย ในโปรคาริโอต บทบาทของลำดับ Kozak ดำเนินการโดยลำดับ Shine–Dalgarno ซึ่งเชื่อมต่อโดยตรง (ในความหมาย - ไม่มีตัวกลาง ซึ่งต่างจากลำดับ Kozak) เชื่อมต่อกับไรโบโซม หลังจากนั้นการสังเคราะห์โปรตีนจึงเริ่มต้นขึ้น
- ลำดับ Kozak ตั้งอยู่ ก่อนยีนที่ใส่เข้าไป ก หลังจากควรมีส่วนสั้นๆ อีกหลายๆ ส่วนซึ่งโปรตีนทำหน้าที่ได้ โพลีอะดีนิเลชั่น(ดู Polyadenylation) - ติดหางโพลีอะดีนีนเข้ากับส่วนท้ายของ RNA ที่เพิ่งสังเคราะห์ใหม่ หางนี้ทำหน้าที่หลายอย่าง รวมถึงรับประกันการส่งออก RNA ไปยังไซโตพลาสซึมและช่วยจัดระเบียบการแปล กล่าวคือ หากเราต้องการให้แน่ใจว่าการสังเคราะห์โปรตีนตาม RNA ของเรา เราก็จะทำไม่ได้หากไม่มีมัน
- และอีกอย่างหนึ่ง mRNA ที่ทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์โปรตีนสามารถคัดลอกได้โดย RNA polymerase ประเภท II เท่านั้น ดังนั้นเราจึงจำเป็นต้องแทรกโปรโมเตอร์ที่ทำงานร่วมกับ RNA polymerase นี้เข้าไปในพลาสมิด
ดังนั้นเราจึงได้เลือกชิ้นส่วนทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับพลาสมิด แต่เพียงเชื่อมต่อเข้าด้วยกันนั้นไม่เพียงพอ - ตำแหน่งสัมพัทธ์ของพวกเขามีบทบาทอย่างมาก ตัวอย่างเช่น ไซต์จำกัดต้องไม่เพียงแต่มีจำนวนมากและหลากหลายเท่านั้น แต่ยังต้องอยู่ในตำแหน่งที่ "ถูกต้อง" ด้วย ในเวลาเดียวกัน เราต้องพยายามให้แน่ใจว่าพลาสมิดสุดท้ายมีขนาดกะทัดรัดที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ เพราะประการแรก มันจะมีเสถียรภาพมากขึ้น และประการที่สอง เซลล์จะ "กลืน" ได้ง่ายขึ้น คุณอาจรู้แล้วว่าการออกแบบพลาสมิดที่ดีนั้นเป็นงานศิลปะที่ละเอียดอ่อนและเป็นลวดลาย
ฐานข้อมูลพลาสมิด
ในช่วงไม่กี่ทศวรรษที่มีการโคลนนิ่งระดับโมเลกุล พลาสมิดที่แตกต่างกันหลายพันชนิดได้ถูกสังเคราะห์ขึ้น ซึ่งเป็นที่มาของฐานข้อมูลขนาดยักษ์ที่ถูกสร้างขึ้น (เช่น แอดจีน) ฐานข้อมูลเหล่านี้ประกอบด้วยพลาสมิดสำหรับทุกโอกาส โดยมีต้นกำเนิดการจำลองประเภทต่างๆ พอลิลิงก์เกอร์ต่างๆ ที่ตั้งอยู่ในตำแหน่งต่างๆ เครื่องหมายเลือกและโปรโมเตอร์ที่แตกต่างกัน และอื่นๆ มีสิ่งที่คุณสามารถเย็บได้ไม่เพียงแค่เม็ดมีดอันเดียว แต่มีหลายอันและยังมีอีกหลายเม็ดที่มีเม็ดมีดยอดนิยมอยู่แล้ว ดังนั้นตามกฎแล้วนักวิจัยจะไม่สังเคราะห์พลาสมิดสำหรับการโคลนนิ่งตัวเอง แต่ซื้อพลาสมิดสำเร็จรูป หากจำเป็น พลาสมิดที่ซื้อมาสามารถ "เสร็จสิ้น" ได้โดยการแทรกหรือลบบางส่วนออก (และจากนั้นก็สามารถเพิ่มพลาสมิดที่ดัดแปลงนี้ลงในฐานข้อมูลได้ด้วย) กล่าวอีกนัยหนึ่ง งานของนักวิทยาศาสตร์มักเป็นเพียงการเลือกพลาสมิดที่เหมาะสม
เวกเตอร์อื่นๆ
พลาสมิดเป็นเวกเตอร์ที่ดีเยี่ยมสำหรับเม็ดมีดที่มีขนาดค่อนข้างเล็ก หากการแทรกของยีนมีขนาดใหญ่เกินไป พลาสมิดจะสูญเสียความเสถียรเนื่องจากส่วนของมันเริ่ม "สับเปลี่ยน" ซึ่งกันและกันและหายไประหว่างการจำลอง ซึ่งเป็นเหตุผลว่าทำไมจึงค่อยๆ สั้นลง ดังนั้นจึงใช้โครงสร้างที่มีความเสถียรมากขึ้นเป็นเวกเตอร์สำหรับเม็ดมีดขนาดยาว ตัวอย่างเช่น:
- คอสมิด้า(ดูคอสมิด) เป็นลูกผสมของพลาสมิดและฟาจ (ไวรัสที่ติดเชื้อแบคทีเรีย) โดยพื้นฐานแล้วมันเป็นเพียงพลาสมิดที่มีตำแหน่งเพิ่มเติมสำหรับการจับกับโปรตีนเคลือบฟาจ (สิ่งเหล่านี้เรียกว่าไซต์คอส ซึ่งเป็นที่มาของชื่อคอสมิด) เปลือกโปรตีนทำให้คอสมิดมีความเสถียรมากขึ้น ทำให้สามารถใส่ส่วนแทรกที่ยาวขึ้นลงไปได้
- โครโมโซมประดิษฐ์(ดูโครโมโซมเทียมของมนุษย์, โครโมโซมเทียมจากแบคทีเรีย, โครโมโซมเทียมของยีสต์) เป็นโครงสร้างที่ซับซ้อนและมีขนาดใหญ่ ซึ่งจริงๆ แล้วคือไมโครโครโมโซม (ดู ไมโครโครโมโซม) พวกมันค่อนข้างเสถียรและในขณะเดียวกันก็มีความสามารถมหาศาล สามารถแทรกยีนหลายตัวเข้าไปในพวกมันได้ในคราวเดียว อย่างไรก็ตามขนาดที่ใหญ่โตทำให้ยากต่อการเลี้ยงในกรง
- และสุดท้ายก็มีเวกเตอร์อีกประเภทหนึ่ง - ไวรัส(ดูเวกเตอร์ไวรัส) สายพันธุ์นี้มีความสำคัญมากจนทั้งส่วนจะทุ่มเทให้กับมันด้านล่าง
เราใส่ยีนเข้าไปในพลาสมิด
สมมติว่านักวิจัยได้เลือกพลาสมิดที่เหมาะสมและได้รับส่วนแทรกที่ต้องการ ตอนนี้คุณต้องเชื่อมต่ออันหนึ่งเข้ากับอีกอันหนึ่งเพื่อที่คุณจะได้ใส่เข้าไปในเซลล์ได้
โดยทำตามขั้นตอนง่ายๆ ไม่กี่ขั้นตอน
ดังที่ได้กล่าวไปแล้ว พลาสมิดมีบริเวณที่มีข้อจำกัดหลายประการ กล่าวคือ บริเวณที่สามารถตัดได้ด้วยเอนไซม์จำกัดที่ต้องการ เราจำเป็นต้องเลือกตำแหน่งที่เหมาะสมซึ่งจะอยู่ในตำแหน่งที่เราจะใส่ส่วนแทรก จากนั้นจึงบำบัดพลาสมิดด้วยเอนไซม์จำกัดที่เหมาะสม
หลังจากนั้น ส่วนแทรกจะต้องได้รับการประมวลผลด้วยเอนไซม์จำกัดเดียวกัน เนื่องจากเอนไซม์จำกัดมักจะปล่อยให้ปลายที่ยื่นออกมาอยู่บนหนึ่งในสาย DNA และปลายเหล่านี้จะต้องเข้ากันได้ระหว่างส่วนแทรกและพลาสมิดเพื่อที่จะ "ตกลง" เพื่อเชื่อมต่อกัน หากไม่มีตำแหน่งจำกัดที่ส่วนท้ายของส่วนแทรก คุณสามารถแนบชิ้นส่วน DNA แบบสั้นที่มีตำแหน่งจำกัดที่กำหนดที่ส่วนปลายได้
และสุดท้าย เราจำเป็นต้องรวมพลาสมิดและส่วนแทรก (ทำให้บริสุทธิ์เบื้องต้นจากเอนไซม์จำกัด) ลงในหลอดทดลองเดียว และเพิ่มเอนไซม์พิเศษที่เรียกว่า DNA ligase (ดู DNA ligase) ซึ่งสามารถแยกส่วน (นั่นคือ เย็บเข้าด้วยกัน) DNA สองอัน โมเลกุล แน่นอนว่าด้วยเหตุนี้เราจะได้รับไม่เพียง แต่เวกเตอร์ที่ต้องการซึ่งพลาสมิดเชื่อมต่อกับส่วนแทรก (ขอเรียกมันว่าแมวเชสเชียร์ด้วยรอยยิ้ม) แต่ยังรวมถึงผลพลอยได้ค็อกเทลทั้งหมดด้วย - พลาสมิดเปล่า (a แมวไม่มีรอยยิ้ม) ผ้าปิดปาก (ยิ้มไม่มีแมว) ผ้าเย็บหลายชิ้นเย็บติดกัน (ยิ้มเยอะๆ) และอื่นๆ ในระหว่างการคัดเลือก ผลิตภัณฑ์ที่ไม่จำเป็นเหล่านี้จะถูกกำจัด และมีเพียงเวกเตอร์เท่านั้นที่จะยังคงอยู่ในมือของเรา
การเลือกเวกเตอร์
ดังนั้นก่อนอื่นเราดำเนินการคัดเลือก
- เราเพิ่มความสามารถของแบคทีเรีย เพิ่ม "ค็อกเทล" ที่ได้รับจากการผูกมัด จากนั้นจึงฉีดวัคซีนแบคทีเรียเหล่านี้บนตัวกลางที่มียาปฏิชีวนะ ซึ่งเป็นเครื่องหมายคัดเลือกตัวแรกของเรา
- เราคัดเลือกโคลนแบคทีเรียที่เติบโตบนอาหารที่มียาปฏิชีวนะ พวกมันสามารถกินพลาสมิดที่มีส่วนแทรก หรืออย่างน้อยก็แค่พลาสมิด (แมว - มีหรือไม่มีรอยยิ้ม)
- เราดำเนินการคัดเลือกขั้นตอนที่สองด้วยโคลนเหล่านี้ ขึ้นอยู่กับยีนที่เราใช้เป็นเครื่องหมายคัดเลือกลำดับที่สอง ตัวอย่างเช่น หากยีนนี้ต้านทานต่อยาปฏิชีวนะตัวอื่น เราจะถ่ายโอนแบคทีเรียไปยังตัวกลางที่มียาปฏิชีวนะนี้ และเลือกโคลนเหล่านั้นที่ถูกยับยั้งการเจริญเติบโต - พวกมันสามารถกลืนได้ไม่ใช่แค่พลาสมิดเท่านั้น แต่ยังกลืนพลาสมิดที่เย็บส่วนที่แทรกเข้าไปด้วย (แมวยิ้ม).
- เราเพาะเลี้ยงแบคทีเรียที่เกิดขึ้น
และแล้วเราก็เข้าใจแล้ว - วัฒนธรรมของแบคทีเรีย ซึ่งเวกเตอร์ที่เราสร้างชีวิตขึ้นมา ค่อนข้างเป็นไปได้ว่านี่คือเป้าหมายสูงสุดของเรา และตอนนี้เราซึ่งมีความสงบและมีความสุข ก็สามารถเปิดการแสดงออกของยีนที่แทรกอยู่ในแบคทีเรีย และเก็บเกี่ยวผลผลิตโปรตีนที่สังเคราะห์ขึ้นมาได้
แต่ถ้าเราต้องการเวกเตอร์บริสุทธิ์ที่สามารถใส่ลงในเซลล์อื่นได้ เราก็จะมีปัญหาที่ดูเหมือนไม่ละลายน้ำ จะช่วยเวกเตอร์จากแบคทีเรียได้อย่างไร? ท้ายที่สุดแม้ว่าเราจะแยก DNA ออกจากแบคทีเรียเหล่านี้ นอกจากเวกเตอร์แล้วเรายังจะได้รับโครโมโซมของแบคทีเรียที่ไม่จำเป็นอีกด้วย
ที่นี่คุณสามารถใช้ประโยชน์จากข้อเท็จจริงที่ว่าพลาสมิด DNA มีความแตกต่างที่สำคัญจากโครโมโซม DNA: ประการแรกมันมีขนาดเล็กกว่ามากและประการที่สอง มันมี supercoiled มากกว่ามาก (เกี่ยวกับ supercoil คืออะไร ดู DNA supercoil หรือ DNA supercoiling) . ดังนั้นจึงเป็นไปได้ที่จะเลือกสภาวะที่โครโมโซมของแบคทีเรียจะตกตะกอนในขณะที่พลาสมิดยังคงลอยอยู่ในสารละลาย มันจะเพียงพอที่จะปั่นแยกตะกอนที่เกิดขึ้น (เพื่อให้ DNA ของแบคทีเรียทั้งหมด "ตกลงไปที่ด้านล่างอย่างแน่นหนา") จากนั้นแยกพลาสมิดของเราออกจากส่วนเหนือตะกอน (โดยปกติจะใช้คอลัมน์พิเศษสำหรับสิ่งนี้ซึ่งช่วยอำนวยความสะดวกและเร่งการทำงานอย่างมาก ).
วิธีใส่เวกเตอร์ลงในเซลล์
และตอนนี้ช่วงเวลาที่ปรารถนาก็มาถึงแล้ว นักวิจัยถือหลอดทดลองในมือซึ่งมีของเหลวใสกระเด็น - เวกเตอร์ที่ได้มาจากความพยายามอย่างมาก
แล้วสิ่งกีดขวางก็เกิดขึ้นตรงหน้าเขา เซลล์ที่เขาวางแผนจะวางเวกเตอร์ของเขาปฏิเสธที่จะ "กลืน" เวกเตอร์นั้น
ความจริงก็คือเยื่อหุ้มไขมันที่ล้อมรอบเซลล์มีความสามารถในการซึมผ่านแบบเลือกได้นั่นคือช่วยให้อนุภาคบางส่วนผ่านไปได้และไม่อนุญาตให้อนุภาคอื่นผ่านได้ โมเลกุลที่มีประจุขนาดใหญ่ (ซึ่งก็คือ DNA นั่นเอง) ไม่สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์นี้ได้เองตามธรรมชาติ และถ้าตัวอย่างเช่นแบคทีเรียสามารถกลืนพลาสมิดจากสภาพแวดล้อมภายนอกได้ (ดังที่ได้กล่าวไปแล้วข้างต้น) เซลล์สัตว์ก็ไม่มีแนวโน้มที่จะทำเช่นนี้เลย ดังนั้นเพื่อที่จะวางเวกเตอร์ลงในเซลล์ ผู้วิจัยจึงต้องใช้กลเม็ดต่างๆ มากมาย ซึ่งจะมีการหารือกันในตอนนี้ แต่ก่อนอื่นมีข้อกำหนดบางประการ
มีการกำหนดหลายรูปแบบสำหรับการนำเวกเตอร์เข้าสู่เซลล์ ขึ้นอยู่กับว่าเวกเตอร์ใดที่ใช้และเข้าไปในเซลล์ใด
AAV มีพฤติกรรมเงียบๆ สุภาพ และไม่เกะกะเท่าที่ใครจะคาดหวังได้จากไวรัส เกือบสิ่งเดียวที่มันทำเพียงครั้งเดียวในเซลล์คือการรวมเข้ากับจีโนมของโฮสต์ และเกือบจะไม่ใช่ที่แรกที่ตามมาเสมอไป แต่อยู่ในตำแหน่งที่กำหนดไว้อย่างเคร่งครัด เมื่อพิจารณาจากข้อมูลที่มีอยู่ในปัจจุบัน มันไม่ก่อให้เกิดโรคใด ๆ ดังนั้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันจึงอ่อนแอมาก นอกจากนี้ยังสามารถแพร่เชื้อได้ทั้งเซลล์ที่มีการแบ่งตัวและเซลล์ที่ไม่แบ่งตัว พูดง่ายๆ ก็คือ AAV เป็นเพียงพื้นฐานในอุดมคติสำหรับเวกเตอร์ แม้ว่าจะไม่ได้มีข้อบกพร่องบางประการก็ตาม
และข้อเสียเปรียบหลักคือความจุน้อย เม็ดมีดที่มีขนาดเล็กมากเท่านั้นที่สามารถ "พอดี" เข้ากับเวกเตอร์ AAV ได้ และในกรณีนี้สิ่งนี้จะด้อยกว่ามากเช่น เลนติเวกเตอร์
นอกจากนี้ AAV ยังเป็นไวรัสที่มีข้อบกพร่องและไม่เป็นอิสระ สามารถแพร่พันธุ์ได้เฉพาะในเซลล์ที่ติดเชื้อ adenovirus อยู่แล้ว (ตามที่แสดงในชื่อ) นี่ไม่ใช่คุณลักษณะที่ไม่ดีเลยหากเราต้องการทำให้การเพาะเลี้ยงเซลล์ติดเชื้อด้วยเวกเตอร์ของเรา แต่ถ้าเราจะสร้างเวกเตอร์สำหรับยีนบำบัด (วิธีการรักษาทางพันธุกรรม - และไม่เพียงแต่ - โรคที่ร่างกายติดเชื้อไวรัสพาหะที่มียีนที่จำเป็นสำหรับสิ่งมีชีวิตนี้) ความบกพร่องดังกล่าวจะขัดขวางเราอย่างมาก เพราะไวรัสจะไม่สามารถแพร่กระจายไปทั่วร่างกายได้อย่างเหมาะสม อย่างไรก็ตาม ดูเหมือนว่าปัญหานี้จะได้รับการแก้ไขแล้ว และเวกเตอร์ AAV ได้รับการพัฒนาซึ่งสามารถสืบพันธุ์ได้ด้วยตัวเอง โดยไม่ต้องอาศัยความช่วยเหลือใดๆ
สมมติว่ามีการเลือกไวรัสที่เหมาะสมแล้ว ตอนนี้เกมกับจีโนมของเขาเริ่มต้นขึ้นแล้ว
1. ขั้นแรก เราต้องสร้างพื้นที่ในจีโนมนี้ กล่าวคือ โยนยีนบางส่วนออกไป มีความจำเป็นที่จะต้องออกจากบริเวณที่เปลือกเกาะอยู่ (เพื่อให้เวกเตอร์ของเราเป็นไวรัสที่ "แต่งตัว") และยีนเหล่านั้นที่รับรองการรวมจีโนมของไวรัสเข้ากับจีโนมของเซลล์เจ้าบ้าน (ดังนั้น สามารถบรรลุวัตถุประสงค์ได้) ในขณะที่ส่วนอื่นๆ เช่น เคลือบยีนโปรตีน เราสามารถกำจัดออกไปได้ด้วยมโนธรรมที่ชัดเจน
2. พลาสมิดถูกสร้างขึ้นจาก "ต้นขั้ว" ของจีโนม - ชิ้นส่วนที่อธิบายไว้ข้างต้นจะถูกแทรกเข้าไป (ต้นกำเนิดของการจำลองแบบ, เครื่องหมายที่เลือกสรรและอื่น ๆ ) โดยหลักการแล้ว พลาสมิดดังกล่าวมีอยู่แล้วในฐานข้อมูลพลาสมิด และตามกฎแล้ว งานของผู้วิจัยคือการเลือกพลาสมิดที่เหมาะสม
3. เม็ดมีดที่จำเป็นถูกเย็บลงในพลาสมิดนี้ (พร้อมตัวเลือกแบบหลายขั้นตอนที่อธิบายไว้ข้างต้น)
ตอนนี้เรามีปัญหาเล็กน้อย แม้ว่าเราจะวางพลาสมิดนี้ไว้ในเซลล์ เราก็จะไม่ได้รับไวรัสใด ๆ เนื่องจากเราได้โยนยีนที่จำเป็นในการสร้างพวกมันออกไปแล้ว (ในจุดที่ 1) ดังนั้นเราก็เลยต้องใช้ทริคเล็กๆ น้อยๆ
เราจะไม่ใส่พลาสมิดหนึ่งตัวเข้าไปในเซลล์ แต่มีสองอัน ตัวแรก ตัวหลัก (เรียกว่า Pu) เป็นตัวที่เราได้รับในขั้นตอนที่ 3 และตัวที่สอง ตัวเสริม (เรียกว่า Me) จะนำยีนที่เราโยนออกไปในขั้นตอนที่ 1 พลาสมิดทั้งสองจะเริ่ม ทวีคูณในเซลล์เจ้าบ้าน Me plasmid จะแสดงโปรตีนของมัน - ตัวอย่างเช่น โปรตีนซองจดหมายและโปรตีนที่จำเป็นสำหรับการประกอบตัวเองของไวรัส เนื่องจาก Pu มีพื้นที่สำหรับให้โปรตีนจากเปลือกเกาะติด โปรตีนเหล่านี้จะเกาะติดกับมัน และผลก็คือ เราจะได้ไวรัสที่มียีนที่จำเป็นอยู่ข้างใน ซึ่งเป็นสิ่งที่เราต้องการ
ดังนั้นแผนปฏิบัติการของเราคือ:
4. เราเลือกเซลล์บางเซลล์ที่เหมาะกับการเปลี่ยนถ่าย (เซลล์นี้เรียกว่า "บรรจุภัณฑ์" โดยปกติจะเป็นเซลล์ไตของตัวอ่อนมนุษย์ HEK293 ดูเซลล์ HEK) และวางพลาสมิดสองตัวลงในเซลล์เหล่านั้นพร้อมกัน - Pu และ Me หลักและเสริม
5. เรารอสักระยะหนึ่ง (ประมาณสองวัน) เพื่อให้ไวรัสก่อตัว หลังจากนั้น เราจะรวบรวมสภาพแวดล้อมที่เซลล์อาศัยอยู่ - ไวรัสที่ลอยอยู่ในนั้น
6. เรากำจัดไวรัสที่เกิดขึ้น (ตามกฎแล้ว จะใช้การหมุนเหวี่ยงและการกรอง) และ...
7. เราใช้พวกมันตามจุดประสงค์นั่นคือเราติดเชื้อในเซลล์ที่เราจะทำการทดลอง
แน่นอนว่านี่เป็นเพียงโครงร่างทั่วไป แต่ละเวกเตอร์เฉพาะมีความแตกต่างกัน ตัวอย่างเช่นมันเกิดขึ้นว่าแทนที่จะใช้พลาสมิดเสริมตัวเดียวจะใช้สองหรือสามตัวแทน หากต้องการสร้างเวกเตอร์ AAV บางส่วน เซลล์บรรจุภัณฑ์จะต้องติดไวรัสอะดีโนไวรัส และถ้าเราสร้างเวกเตอร์สำหรับการบำบัดด้วยยีน ซึ่งควรจะสามารถขยายพันธุ์ในเซลล์เจ้าบ้านและแพร่เชื้อไปยังเพื่อนบ้านได้ เราก็จะต้องจัดการจีโนมของไวรัสอย่างระมัดระวังมากขึ้น และเคลียร์พื้นที่ในนั้นด้วยความระมัดระวังอย่างยิ่ง เพื่อไม่ให้รบกวน ความสามารถของไวรัสในการแพร่พันธุ์อย่างอิสระ และอื่นๆ
ขั้นตอนสุดท้าย
ดังนั้น - ไชโย! - ไม่ทางใดก็ทางหนึ่งเรายังคงวางเวกเตอร์ลงในเซลล์ได้ ขั้นตอนสุดท้ายยังคงอยู่สำหรับเรา - เราต้องเลือกจากเซลล์ทั้งหมดที่มีการรวม DNA เวกเตอร์เข้ากับจีโนมของพวกเขา
จริงๆ แล้ว เพื่อจุดประสงค์นี้ เราได้เพิ่มเครื่องหมายเลือกตัวสุดท้ายลงในเวกเตอร์ ซึ่งเป็นยีนสำหรับการต้านทานยาปฏิชีวนะที่ทำงานบนเซลล์ยูคาริโอต เราจะเพิ่มยาปฏิชีวนะนี้ลงในสภาพแวดล้อมที่เซลล์ของเราตั้งอยู่อย่างต่อเนื่อง ด้วยเหตุนี้ เฉพาะผู้ที่มียีนนี้ในจีโนมและ DNA เวกเตอร์ทั้งหมดของเราเพิ่มเติมเท่านั้นที่จะอยู่รอดและสามารถแบ่งตัวได้
ทั้งหมด! การโคลนนิ่งเสร็จสมบูรณ์ เราได้รับเซลล์ดัดแปลงพันธุกรรมจำนวนหนึ่ง ซึ่งมีจีโนมซึ่งมีส่วนแทรกของเราอยู่ ถึงเวลาที่ต้องทำการทดลองที่จำเป็นกับเซลล์เหล่านี้แล้ว